聚合酶链式反应（PCR）?

原理?

DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对

原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。?PCR由变性-退火(复性-延伸三个基本反应步骤构成：?

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；?

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；?

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的?半保留复制链?，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。??

PCR技术分类（常用）?

（1）反向PCR技术(Inverse?PCR,?IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无

切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性DNA的片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段?。?

（2）锚定PCR技术(Anchored?PCR,?APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,?然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,?称为APCR。?

（3）不对称PCR技术(asymmetric?PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,?常用50～100÷1比例。在初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA,?但当低浓度引物被消耗尽后,?高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。?

（4）反转录PCR技术(reverse?transcription?PCR,?RT-PCR)：当扩增模板为RNA时,?需先通过反转录酶将其反转录为cDNA

才能进行扩增。应用非常广泛,?无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。?

（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,?然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,?此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,?且用量较少,?同时在次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,?这样在次PCR时,?由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,?故只有外引物扩增产物,?经过若干次循环,?待外引物基本消耗尽,?无需取出次PCR产物,?只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤,?同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。?

（6）多重PCR技术(multiplex?PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的

电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。?

（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,?两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互

补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR?条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。?

（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的

检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。?

（9）荧光定量实时PCR技术

反应动力学?

????PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，终DNA扩增量可用Y=(1+X)n

计算，Y代表DNA的片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA的片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA的片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现?停滞效应?，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。??

PCR扩增产物?

????可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA的片段供分析、监测。??

反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+?

（1）引物设计？?

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。??

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。??

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC理想随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】?

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。?

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，?被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。??

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。?

⑧引物量：?每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。?

（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq?DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5?U/50?ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。??

（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M?NaOH或1M?Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(?等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。??

（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：?溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS?还能与蛋白质结合而沉淀；?蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。?

（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq?DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

RT-PCR--是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。?

①总RNA提取（-70℃保存）?

Trizol法：?

1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1ml?Trizol?冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）?

2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min?

3、加0.2ml（总体积的1/5），振荡混合，室温放臵5min?

4、4℃，离心12000?rpm，15min??

5、取上层液相（约400μl）移入一新1.5ml?EP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min?

6、4℃，离心12000?rpm，10min?

7、弃上清液，加1ml?75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合?8、4℃，离心7500?rpm，5min?

9、弃上清液，室温放臵20min(EP管倒臵在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能*干燥）?

10、加20ul?DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（?可保存在液氮或低温冰箱-70℃）??

测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值?

调零：750ul?DEPC水?

测量：745ul?DEPC水?+?5ul?RNA?

总RNA浓度=?OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml?????????????

                =?OD260×40×150?ug/ml?????????????

                =?OD260×6?ug/ul?

A1/A2应在1.8-2.0之间?

注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，后一条5s的应该比较淡。???

②逆转录RT（cDNA：一周内-20℃保存，长期-70℃保存）?

RT反应体系：20ul体系?

步：约20分钟?

RNA抽提物????????????5μl?

Radome引物???????????2μl?

RNAsin??????????????0.5μl?

1、65℃?15分钟??

2、立即放入冰浴???

第二步：约2小时?

RNAsin??????????????0.5μl?

10mM?dNTP?????????1μl?

5×?RT缓冲液??????????4μl?

25mM?MgCl2?????????4μl??????

AMV???????????????? ?3μl?

1、37℃?1.5小时??

2、94℃?5-10分钟??

3、反应物保存于-20℃或进行PCR