一、实验原理

 

　　紫外-可见分光光度法基于溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收。对于蛋白质而言，其内部的酪氨酸和色氨酸残基中的苯环含有共轭双键，这些基团在275-280nm波长范围内具有一个强烈的吸收峰。因此，可以通过测量蛋白质溶液在280nm处的吸光度（A），利用朗伯-比尔定律（A=ebc）来计算蛋白质的浓度。其中，A为吸光度，e为摩尔吸光系数，b为光程长度，c为浓度。

 

　　二、实验材料

 

　　仪器：TU-1901紫外可见分光光度计、石英比色皿（1cm光程）

 

　　试剂：标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白BSA，已知浓度）、待测蛋白质溶液、0.9%NaCl溶液（作为参比溶液）、双缩脲试剂（用于其他方法时可选择）、苯酚试剂（用于其他方法时可选择）

 

　　工具：吸量管、比色管、擦镜纸等

 

　　三、实验步骤

 

　　1.仪器准备

 

　　开机预热：打开紫外分光光度计电源开关，预热20-30分钟。

 

　　波长设置：预热完成后，按GOTOλ键，输入所需的波长（如280nm），按ENTER键确认。

 

　　2.参比溶液设置

 

　　清洗比色皿：用擦镜纸轻轻擦拭比色皿的光滑面，确保其干净无污渍。

 

　　参比溶液加入：向比色皿中加入适量的0.9%NaCl溶液，轻轻摇匀后放入光度计凹槽中，盖好盖子。

 

　　调零：按ZERO键进行调零操作，确保仪器读数准确。

 

　　3.标准曲线绘制

 

　　溶液稀释：使用吸量管吸取已知浓度的标准蛋白质溶液，加入比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至不同浓度（如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等）。

 

　　吸光度测量：将稀释后的标准溶液依次加入比色皿中，在280nm波长下测量各溶液的吸光度，并记录数据。

 

　　绘制标准曲线：以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

 

　　4.待测样品测定

 

　　样品准备：将待测蛋白质溶液用0.9%NaCl溶液稀释至适当浓度。

 

　　吸光度测量：将稀释后的待测样品加入比色皿中，在280nm波长下测量其吸光度。

 

　　浓度计算：根据标准曲线，查找或计算待测样品的蛋白质浓度。

 

　　四、注意事项

 

　　仪器预热：确保仪器预热足够时间，以提高测量精度。

 

　　比色皿清洁：比色皿应保持干净，避免划痕和污渍影响测量。

 

　　波长设置：根据实验需要设置正确的波长，通常为280nm。

 

　　参比溶液：参比溶液应与待测溶液具有相似的物理和化学性质，以减少误差。

 

　　样品稀释：待测样品应稀释至适当浓度，以避免吸光度超出仪器测量范围。