PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

1、热启动PCR

常规PCR的扩增开始时间并不是放进PCR仪，运转程序才开始扩增。当体系配置完成的时候，扩增就开始了，这可能会引起非特异性扩增出现，热启动PCR可以解决这一问题。什么是热启动PCR?当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动"阶段，酶修饰物在高温下(通常高于90C)被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。该方法主要利用抗体、亲合配体、或化学修饰物等修饰物，来抑制的DNA聚合酶的活性。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且无需牺牲PCR反应的特异性。

2、逆转录PCR

逆转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)，是从mRNA逆转录成cDNA并以此为模板进行扩增的一种实验技术。实验流程是先提取组织或细胞中的总RNA，以Oligo(dT)为引物，利用逆转录酶合成cDNA，再以CDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

3、荧光定量PCR

荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。常用的qPCR方法有荧光染料法(SYBR Greenl)和探针法(TaqMan)。染料法(常用SYBR Green I):在PCR反应体系中，加入过量SYBR英光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步探针法(常用TaqMan探针):探针完整时，报告基团发射的光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成同步。

4、巢式PCR

巢式PCR(NestedPCR)是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，第轮的扩增产物才是目的基因片段。如果第一对引物(外引物)的错配导致非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升进行两轮PCR的一个优势在于:有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。巢式PCR的实验原理为根据DNA模板序列设计两对引物，利用第一对引物(称为外引物)对靶DNA进行15-30个循环的标准扩增;第一轮扩增结束后将一小部分起始扩增产物稀释100-1000倍加入到第二轮扩增体系中作为模板，利用第二对引物(称为内引物或巢式引物，结合在第轮PCR产物的内部，进行15-30个循环的扩增，第二轮PCR的扩增片段短于第一轮。

5、降落PCR

降落PCR(Touchdown PCR)是一种通过调整PCR循环参数，提升PCR反应特异性的方法。在降落PCR中，前几个循环的退火温度设定为，比引物的最高退火温度(Tm)再高几度。较高的退火温度能有效减少非特异性扩增，但同时较高的退火温度会加剧引物与目标序列的分离，导致PCR的产量降低。因此在开始的几个循环中，退火温度通常设置为每个循环降低1℃，以增加体系中目的基因的含量。当退火温度降低到最佳温度时，剩余循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，而几乎不会出现非特异性的产物。

6、直接PCR

直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR分两类，直接法:取少量样本直接加入到PCR Master Mix中，进行PCR鉴定;裂解法:样本取样后，加入裂解液中，裂解释放基因组，取少量裂解上清液加入到PCR Master Mix中，进行PCR鉴定。这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化步骤DNA的损失。

推荐具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受这些抑制剂，从而使直接PCR成为可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高灵敏度，因此可从未纯化样本中扩增微量的DNA.

7、重叠延伸PCR

重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR，SOEPCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向:构建融合基因;基因定点突变。

8、反向PCR

反向PCR(Inverse PCR,IPCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的末知序列进行扩增。反向PCR设计之初是为了用于确定邻近未知区域的序列，多用于研究基因的启动子序列;致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座;以及病毒基因整合现在也常用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。反向PCR流程，首先对模板进行限制性酶切消化和连接，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接(即形成连环体)完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。

9、数字PCR

数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(RealTime PCR)基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推出原始溶液的核酸浓度。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于诸如低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的绝对定量。